基于合成核酸分子工程的生物醫學應用

　　摘要：核酸結構設計因簡單的堿基配對法則而獲得預測結構的能量支持,且具備更強的折疊合成結構,受到了廣泛的關注.然而,核酸堿基的化學多樣性缺乏,使得核酸結構在功能上多樣性比蛋白質弱,因而限制了其在實際中的應用.本文聚焦核酸分子工程,尤其是對核酸結構以及分子間相互作用的研究;基于核酸結構的空間可尋址性,實現了多種材料在核酸結構上的位點可控的修飾;基于對核酸分子序列的設計,還實現了核酸分子間反應動力學參數的連續微調.此外,設計構建了合成分子化學反應網絡、分子機器及核酸基生物材料,并將這種綠色生物材料應用于生物分子識別、生物膜表面工程及生物催化等方向.

　　關鍵詞：合成核酸分子工程;生物分子識別;細胞表面工程;生物催化;

　　Abstract：The simple rule of base-pairing of nucleic acids enables nucleic acid structures to be designed via powerful energy-based prediction tools. Thus, nucleic acid structures have attracted considerable attention owing to their ability to fold into a variety of synthetic structures. However, the lack of chemical persity of nucleic acid bases makes nucleic acid structures less functionally perse than proteins, thereby limiting their practical applications. This review focuses on the underlying technology of nucleic acid molecular engineering, especially on the studies of nucleic acid structures and their molecular interactions. As nucleic acid structures are fully spatially addressable, a persity of particles could be linked to designated positions on the surface of nucleic acid structures. Additionally, the intermolecular reaction kinetics of nucleic acids could be continuously fine-tuned by rational design of nucleic acid sequences. This review also summarizes the development of synthetic molecular networks, dynamic molecular machines, and nucleic acid-based biomaterials, as well as the application of these as green biomedical devices in biomolecular recognition, cell surface engineering, and biocatalysis.

　　Keyword：synthetic nucleic acid molecular engineering; biomolecular recognition; cell surface engineering; biocatalysis;

　　0 引言

　　核酸分子作為自然界生物遺傳信息的載體,具有獨特的化學或結構特性,例如DNA雙鏈遵循Watson-Crick堿基互補配對原則、序列可編程性和優異生物相容性等[1,2].同時,利用限制性核酸酶、連接酶和聚合酶,研究人員能夠實現對核酸分子的剪切、連接、復制和延伸等操作[1,2].近年來,核酸分子合成技術的不斷進步,以及其價格的降低,促進了核酸納米技術領域的迅速發展[3,4].核酸納米技術可大致分為結構納米技術和動態納米技術[5].一方面,結構納米技術通過核酸分子自下而上的自組裝,實現了不同尺寸的二維和三維結構的構建[6].這些結構在納米尺度上具有空間可尋址性,可以在體外對生物分子進行位點特異性錨定[5,7,8].另一方面,動態核酸納米技術基于可編程的核酸分子間相互作用或分子內構象變化,可以構建具有自主移動或處理信息能力的分子馬達或電路[5,7].對核酸分子反應動力學的定量研究,能夠預測單鏈核酸分子的折疊路徑以及核酸分子間的反應路徑,這是核酸納米技術取得成功的一個關鍵因素[9].長期以來,核酸納米技術取得的進步推動了多個領域的發展,例如基因編輯[10]、智能藥物遞送[11,12,13,14]和綠色催化[4]等.這些進步使人們看到了核酸分子器件在“智能療法”中的巨大應用潛力,尤其是用于生物診斷.已經有研究表明,利用核酸分子器件能夠對多個生物標志物進行同時檢測,并實現準確、快速的疾病診斷[15,16].目前,已經發展的多種體外診斷(in vitro diagnostics,IVD)方法也涉及合成核酸分子器件,例如基于DNA折紙和人工基因電路的埃博拉病毒檢測試紙[17].這些能夠用于護理點的簡單、快速的體外診斷方法的涌現,揭示了合成DNA分子潛在的經濟價值.

　　本文總結了合成核酸分子工程在生物醫學應用中的進展.首先,簡要概述了對核酸結構的合理設計和修飾,描述了對核酸分子間反應和分子運動的動力學的調控方法,闡述了功能切換電路的設計.然后,總結了合成核酸分子工程3個方向的應用:利用合成核酸分子的生物分子識別能力,構建核酸傳感器,實現生物標志物的檢測和疾病的診斷;核酸分子電路用于細胞表面工程化,以實現對細胞行為的調控;在生物催化中,核酸分子用于構建模擬酶和優化酶的催化活性.最后,提出了合成核酸分子工程當前面臨的瓶頸,并指出了其未來的發展方向.

　　1 對核酸結構以及分子間相互作用的研究

　　自20世紀80年代Seeman設計并構建了第一個DNA納米結構以來[18],自組裝DNA納米結構不斷涌現.2006年DNA折紙的問世[19],在結構核酸納米技術領域具有里程碑的意義.在數百條短的訂書釘鏈的輔助下,一條長的DNA支架鏈折疊形成DNA折紙結構(圖1(a))[19,20,21,22,23,24,25].基于DNA分子的序列可編程性和互補鏈間的程序化雜交,通過上述方法,理論上能夠構建任意復雜形狀的二維、三維結構,如笑臉、立方體和半球形等.平面DNA折紙結構的尺寸受到支架鏈的長度的限制,通常為8 000～10 000 nm2.通過合理的設計,多個DNA折紙結構能夠作為模塊進行拼接,合成的結構能夠達到毫米尺度.在DNA折紙結構中,每一條訂書釘鏈經過設計,其位置可輕易確定.因此,折紙結構具有空間可尋址能力,可以將修飾分子錨定在指定的位置.每40～50 nm2內存在1個可尋址點.

　　基于其空間可尋址的特性,研究人員能夠從設計層面上改造DNA折紙結構.在DNA折紙結構上,通過找到預設的可尋址點或具有一定間距的多個可尋址點所在的訂書釘鏈,可對其進行功能化修飾[8].通過對訂書釘鏈的修飾,諸如延伸出捕獲鏈或連接生物素,多種分子或結構能夠被錨定在DNA折紙結構表面,使其獲得新的功能(圖1(b))[8,11,26].例如,通過精確控制捕獲鏈在棒狀DNA折紙結構上的位置,可實現對平行金納米棒簇三維空間配置的控制[27].

　　在結構核酸納米技術發展的同時,動態核酸納米技術也取得了巨大的進步.基于DNA鏈置換反應,AND和OR等基礎邏輯門以及DNA分子電路等計算器件被構建.鏈置換反應的過程:在toehold區域的觸發下,一條DNA單鏈取代DNA雙鏈中的一條鏈,并與另一條鏈雜交.通過調整toehold區域的長度和序列,可實現對鏈置換反應速率6個數量級范圍的調控.在此基礎上,本文課題組提出了精細調控DNA鏈置換反應動力學的策略[28].在這一策略中,能夠發生分子內構象變化的發夾結構作為分子開關模塊被插入到toehold區域與分支遷移域之間,通過調控發夾結構莖和環的長度實現了鏈置換反應動力學的連續微調.進一步利用協同變構的DNA開關,設計了DNA I/O(input/output)控制器,實現了DNA鏈置換反應動力學的非線性調控,希爾系數可達2.70[29].

圖1 核酸納米技術的發展

　　通過對序列的合理設計,上游DNA鏈置換反應的產物能夠作為輸入,用來觸發下游反應的發生,從而實現反應的級聯.基于此,研究人員設計并構建了具有特定功能的DNA電路[30].將DNA電路進一步與刺激響應材料結合,構建了對外界刺激具有響應能力的DNA功能切換電路(圖1(c)).該工作以光控DNA功能切換電路作為一個經典的例子[31],將紫外光(Ultraviolet,UV)響應的光致變色分子(螺吡喃)引入到反應體系中.在初始狀態下,三鏈體結構的DNA開關能夠與輸入鏈發生反應;在紫外光照射下,螺吡喃發生變構并誘導三鏈體結構轉化為雙鏈結構,通過阻礙與輸入鏈的反應實現功能的轉化.此外,研究人員還設計并構建了p H響應的功能切換電路[32,33].

　　目前,研究人員將動態DNA納米技術與靜態DNA納米技術相結合,實現了具有動態行為的分子機器,如能夠開閉的DNA六邊形桶狀結構[34]、局域化分子電路[35]及DNA步行者[36]等.

　　2 在生物醫學領域的應用

　　基于其優異的生物相容性和低細胞毒性,核酸分子在體內應用中顯示出獨特的優勢[37].結合其易于修飾、可編程等特點,基于核酸的分子機器在生物醫學領域表現出極大的應用潛力.本文從3個方面來簡述合成DNA分子工程的應用潛力:生物分子識別、生物膜表面修飾和生物催化.

　　2.1 生物分子識別

　　生物分子識別依賴于識別元件和靶標之間的特異性結合[38,39].經核酸適配體或官能團修飾,核酸結構能夠作為識別元件靶向多種目標,包括核酸、蛋白、離子,甚至整個細胞.此類具有生物分子識別能力的DNA結構可以應用于生物傳感等領域[40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60].

　　受馬達蛋白的啟發,研究人員創造出了人工分子機器人—DNA步行者.其中,行走元件能夠在驅動力的作用下沿著步行軌道穩定、漸進地運動[2].將DNA識別元件與步行者的行走元件相結合,識別元件捕獲靶標后,引發信號的產生,隨著步行者的多步行走,進一步實現信號的放大,這一過程可用于構建高靈敏生物傳感器.基于此,本文課題組設計并構建了一種隨機DNA步行者,它以一條DNA單鏈作為行走元件,以核酸外切酶Ⅲ為驅動力,在DNA鏈修飾的金納米粒子上移動[61].當行走元件結合到一條軌道鏈上之后,軌道鏈會在酶的作用下被水解,從而產生信號.而釋放的行走元件會結合到下一條軌道鏈上,通過多次循環實現信號放大.在此基礎上,進一步構建了雙步行者系統,目標細菌能夠與識別元件結合,從而釋放兩類行走鏈,分別觸發兩類步行者上信號的產生及擴增,實現快速靈敏的生物傳感[62].此外,有研究報道使用雙鏈特異性核酸酶作為驅動力,以吸附在Mo S2納米片上的DNA發夾作為行走軌道,發展了能夠用于mi RNA識別和檢測的RNA步行者[63,64].更進一步地,基于單壁碳納米管的RNA步行者也被開發并應用于mi RNA識別和胞內成像[65].為了實現對靶標的超高通量檢測,研究人員將隨機DNA步行者與基于液滴的微流體策略結合,采用基于熒光種類和強度的二維編碼策略,構建了具有超多重檢測能力的生物傳感器,理論上可以識別和區分9種細菌的511種不同組合(圖2)[66].

圖2 隨機DNA步行者-液滴平臺用于細菌的超多重檢測[66]

　　2.2 生物膜表面修飾

　　細胞膜是細胞與其環境之間發生交互的主要介質[67].開發細胞膜上的分子工程策略可以用于調節細胞與環境之間的交互作用.目前,調控細胞膜表面受體的常用工具是基因編輯.基因編輯是一種能夠對生物基因組進行修飾的強有力的工具,利用編輯工具對基因“改寫”,從而改變細胞膜表面受體的表達.但這種方法操作復雜,存在脫靶的可能性,并且可能會造成基因組結構突變.相比于基因編輯,利用細胞表面工程也能夠實現相似的功能,并且可規避上述問題.研究人員已經發展了各種策略來實現細胞表面工程[68].例如,利用合成細胞黏附肽(arginylglycylaspartic acid,RGD)將DNA電路修飾在細胞膜表面,通過改變輸入模式可調控細胞在載玻片表面的黏附和分離行為(圖3(a))[69].此外,基于雜交鏈式反應,研究人員發展了一種基于DNA電路的細胞表面工程策略,可以對細胞-細胞相互作用進行可編程調控,從而選擇性地控制多細胞自組裝路徑(圖3(b))[70].近期,基于DNA概率電路,研究人員提出了一種可精確調節細胞膜上的人工受體聚集程度的策略(圖3(c)),這一策略可以調控自然殺傷細胞與癌細胞之間相互作用,從而促進有效的癌細胞殺傷[71].該研究為精確控制細胞識別和發展基于細胞的免疫治療提供了有效工具.除對細胞膜外表面進行人工核酸分子修飾之外,基于核酸的細胞膜內表面工程化進一步擴展了功能性核酸分子在細胞生物學中的應用,這一方面的研究也引起了廣泛關注.例如,邢航課題組提出了一種基于融合性球形核酸的可在空間上控制膜表面工程化的仿生策略[72].依賴這一膜融合策略,可以精準控制DNA鏈在細胞膜內表面或外表面的高效修飾,并以此實現了對細胞間通信的調節以及細胞內代謝物的監測.

圖3 細胞表面工程和智能藥物運輸

　　適配體等靶向元件能夠與細胞膜上蛋白發生特異性相互作用,將靶向元件與藥物載體結合,構建智能藥物遞送系統,這類系統能夠特異性識別腫瘤細胞,實現藥物的靶向遞送,從而提高藥物的運輸效率、降低藥物的全身毒性.基于此,研究人員開發了一種DNA開關調控的水凝膠,用于控制腫瘤殺傷藥物在特定癌細胞中的釋放[13].體系以金納米粒子作為模板,DNA鏈在模板表面發生雜交鏈式反應,形成球形核酸水凝膠.抗癌藥物能夠插入到DNA雙鏈當中.當識別到靶細胞中ATP(adenosine triphosphate)時,DNA雙鏈解旋并釋放藥物(圖3(d)).此外,適配體修飾的DNA折紙結構[11]和金屬有機框架(metal-organic framework,MOF)-生物礦化DNA納米球[12]也被開發用于智能藥物運載系統.

　　2.3 生物催化

　　生物催化是在酶或生物有機體等催化劑的作用下進行化學轉化的過程,它有助于合成化學品、藥物和生物燃料等,對于生物醫學等領域的發展至關重要.生物催化是一種環境友好和經濟有效的催化方法,有望替代傳統金屬催化方法.常見的生物酶包括蛋白、DNA和RNA.為了實現高效的生物催化,Zhong等[73]發展了一種具有與酶相似活性的新型DNA納米纖維水凝膠(G4模擬酶),可用于H2O2和四甲基聯苯胺的氧化還原催化(圖4(a)).G4模擬酶通過鳥嘌呤核苷與KB(OH)4自組裝,并在自組裝過程中插入血紅素,具有顯著的類酶活性.

圖4 基于合成核酸分子的生物催化

　　設計構建高效的生物催化劑可以加速化學反應.然而,在工業化應用中,生物催化劑還需要滿足兩個重要條件:高化學轉化速率和對極端條件的耐受性(包括高溫或低溫,有機溶劑和抑制性試劑等).研究人員通過調控兩個酶分子的間距有效地提高了級聯催化反應的轉化率(圖4(b))[26].基于DNA折紙結構的可編程性和空間可尋址性,兩種酶以不同的間距被錨定在平面核酸結構上,以優化酶級聯催化反應的效率.此外,研究人員還使用多殼金屬有機框架,在納米尺度上對酶進行空間組裝,提高酶的級聯催化活性[74].這種金屬有機框架還能夠作為區室化的反應器,有效避免反應串擾.另一方面,使用MOF封裝脫氧核糖核酸酶(DNAzymes),可以提高酶的穩定性,使其在有機溶劑或高溫條件下依舊具有良好的酶催化活性(圖4(c))[75].

　　3 結論

　　本文總結了合成核酸分子工程在生物醫學應用中的進展.本研究專注于核酸分子底層技術,尤其是對靜態核酸結構的合理設計和修飾,以及對核酸分子間反應和分子運動動力學的調控方法,并且進一步展示了功能切換電路的設計.最后闡述了合成核酸分子工程用于生物分子識別、生物膜表面工程和生物催化這3個方向的研究進展.

　　合成核酸分子工程的蓬勃發展為生物醫學領域帶來了巨大的機遇,但仍然存在一些障礙和發展瓶頸.主要包括:(1)受到穩定性和體內分子串擾的影響,目前功能化DNA分子雖然能夠識別廣泛的靶標,但在生物體液中的檢測能力仍然有限.為了解決這一問題,研究人員將支架結構引入到生物檢測當中[76],以提高體系的穩定性.(2)基于DNA的藥物運輸系統存在細胞攝取率不高、細胞攝取的機制不明確等問題.為此,研究人員針對藥物載體的種類、尺寸和形狀等對細胞攝取的影響進行了研究[77].(3)當核酸分子工程應用于生物領域時,需要在體系中加入特定的工具酶或者對探針鏈進行熒光標記,這無疑會增加體系的成本.為了解決這一問題,非常有必要發展等溫非酶擴增方法和無標記方法.(4)對于DNA納米技術而言,當DNA電路規模擴展到一定程度或DNA納米結構大到一定尺度時,信號泄露和DNA鏈錯誤折疊的概率都會急劇增加,這會導致電路的錯誤輸出,并且影響合成結構的產率和完整性.因此,改進和完善DNA電路或結構的設計和制備技術,對于構建更復雜的DNA電路和組裝更復雜的DNA結構具有重要的意義,也是未來核酸分子工程的發展方向.

　　盡管核酸分子工程仍面臨諸多挑戰,但不可否認的是,其在生物醫學領域發揮著越來越重要的作用,尤其是生物分子的檢測以及疾病的診斷和治療方面.同時,研究人員也在不斷拓展核酸分子工程在熱點領域(如生物安全、表觀遺傳學等)的應用.相信未來經過幾十年的發展,在先進功能性材料的推動下,DNA設計、合成、修飾及組裝技術的發展將達到一個新的水平,有望應用于更廣泛的領域.

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